La producción de café está limitada por plagas que reducen las cosechas y disminuyen su calidad. Los objetivos de esta investigación fueron la identificación de bacterias fitopatógenas, descripción de síntomas en campo y sensibilidad in vitro a bactericidas de uso agrícola. Se seleccionaron cuatro fincas cafetaleras en el departamento de Jinotega y una en el departamento Matagalpa, con antecedentes de enfermedades bacterianas; las muestras de tejido colectadas consistieron en hojas, bandolas, frutos, y flores. La identificación de géneros de bacterias fitopatógenas se realizó a partir de características morfológicas de crecimiento bacteriano y presencia de pigmentos fluorescentes en King B. La identificación de especies de bacteria se realizó con prueba de oxidasa y pruebas de producción de ácidos a partir de carbohidratos. La patogenicidad de las bacterias se evaluó mediante la prueba de hipersensibilidad en plantas de tabaco (Nicotiana tabacum L.) como planta no huésped. La sensibilidad e inhibición de las bacterias a bactericidas se determinó mediante el método de Bauer-Kirby (método de difusión en agar) y fue evaluado en diámetros (mm). Los bactericidas evaluados fueron, clorhidrato de oxitetraciclina 5 WP, estreptomicina más oxitetraciclina 16. 5 WP, ácido oxolínico 20 WP y sulfato de cobre 24 SC. Las especies de bacterias identificadas fueron Pseudomonas syringae, Pseudomonas corrugata . Pseudomonas cichorii. En esta investigación Pseudomonas cichorii fue la más frecuente en los diferentes aislados, Pseudomonas syringae, fue aislada en todas las variedades de café muestreadas. Las especies de bacterias aisladas resultaron positivas a la prueba de hipersensibilidad, indicando ser patógenas para el cultivo de café. Los síntomas en hojas, bandolas y flores causados por Pseudomonas spp son manchas de coloración pardo-oscura, de forma y tamaño irregular, rodeada, generalmente por halos amarillentos y traslucidos. El bactericida que mostró mejor efecto al mostrar mayores diámetros en los halos de inhibición bacteriano fue el ácido oxolínico.

El café es considerado un producto de importancia en la economía mundial y hasta el inicio de la crisis internacional del café, era el segundo producto con más valor en el mercado después del petróleo. Este grano se produce en más de 70 países alrededor del mundo, de estos 45 son miembros de la Organización Internacional del Café (OIC), que en su conjunto representan el 97 % de la producción mundial de café, según el Ministerio de Fomento Industria y Comercio (MIFIC, 2008).

En Nicaragua el café es cultivado por 44 000 productores en un área de 125 874 ha distribuidas en 10 departamentos, predominando el área de siembra en la zona norte del país. Constituye el primer producto de exportación llegando a alcanzar el 18 % total de las exportaciones, con una producción de 2 493 t. Genera el 53 % del empleo agropecuario nacional, el 21 % del PIB agrícola del país y el 2 % de PIB Nacional [Banco Central de Nicaragua, (BCN, 2017)].

Existe una diversidad de plagas insectiles y enfermedades que afectan a este cultivo y juegan un papel fundamental sobre la productividad y rentabilidad de las plantaciones. En las últimas décadas, en los cafetales centroamericanos y otras partes del mundo, se destacan enfermedades como roya del café, ojo de gallo y antracnosis (Avelino y Rivas, 2013). Actualmente la producción de café es mermada al igual que todos los cultivos, por las alteraciones de las condiciones climáticas, que se reflejan en el incremento de las temperaturas, sequias, inundaciones y cambios en los patrones del viento; estos eventos pueden causar cambios en el equilibrio de los agroecosistemas y favorecer el desarrollo de nuevas plagas.

En Brasil las enfermedades bacterianas causadas por el género Pseudomonas fueron detectadas por primera vez a finales de 1955 en cafetales del municipio de Garca, estado de Sao Paulo, incidiendo en hojas, bandolas y frutos. Los síntomas se caracterizan por ser manchas de coloración pardo-oscura, de forma y tamaño irregular, rodeada, generalmente por halos amarillentos (Costa y Silva, 1960). Las enfermedades de origen fungoso han predominado en el sistema café, en zonas cafetaleras de Nicaragua, no obstante, han sido reportada algunas especies de bacteria; como Pseudomonas cichorii Swingle 1925, indica el Instituto de Protección y Sanidad Agropecuaria (IPSA, 2016). Estas enfermedades han sido poco estudiadas y en muchas ocasiones la sintomatología es confundida por deficiencias de nutricionales.

Existe limitada información acerca de la etiología y características sintomatológicas, que ocasionan las bacterias fitopatógenas en este cultivo, así como las condiciones climáticas que favorecen su desarrollo. Para el manejo de estas enfermedades bacterianas en el cultivo del café, se ha incluido las aplicaciones de bactericidas como Estreptomicina + oxitetraciclina 16.5 WP, Estreptomicina 20 SP y Sulfato de cobre más oxitetraciclina 32 SC.

Actualmente entre los principales desafíos en el desarrollo de la caficultura nicaragüense, está el diagnóstico presuntivo de campo de las enfermedades bacterianas y el diagnóstico asertivo de la identificación de las especies bacterianas; utilizando métodos convencionales y moleculares para la respectiva identificación de especies y patovares. El propósito de esta investigación radica en la identificación de especies bacterianas, descripción de los síntomas asociados a las enfermedades que afectan el cultivo de café. Además de la determinación de la sensibilidad in vitro de algunos productos utilizados como bactericidas en el manejo de estas enfermedades. La información obtenida establecerá pautas para próximas investigaciones sobre el comportamiento y epidemiología de las enfermedades bacterianas en el cultivo del café en Nicaragua.

El estudio fuedescriptivo y se desarrolló en dos etapas. En la primera etapa se colectómuestras de tejido vegetal enfermo en plantaciones de café en los departamentosde Matagalpa y Jinotega. La segunda etapa consistió en el procesamiento de lasmuestras en el laboratorio de microbiología vegetal de la Universidad NacionalAgraria, ubicado en el km 12 ½ de la Carretera Norte en Managua, cuyas coordenadasgeográficas corresponden a 12°08’33” latitud Norte y 86°10’31” longitud Oeste.

Las fincascafetaleras fueron seleccionadas por presentar antecedentes de enfermedadesbacterianas. En el departamento de Matagalpa fue seleccionada la finca ElLimón, mientras que en Jinotega las fincas fueron El Cairo, El Palacio, LosPotrerillos y Santa Maura. Se colectó untotal de 30 muestras de tejido vegetal enfermo, que incluyeron hojas, bandolas,flores y frutos. El tipo de colecta fueselectiva o dirigida en plantas con posibles síntomas de enfermedad bacterianay se realizaron anotaciones acerca de las características morfológicas de lossíntomas. En cada finca se levantó el historial del cultivo (área cultivada,variedades, edad de la plantación, manejo fitosanitario, otros manejosagronómicos, temperatura y altitud).

Sedescribieron los síntomas de muestras de tejido colectadas. Estas fueronobservadas al estereoscopio y se seleccionaron muestras con características demanchas bacterianas y presencia de exudados bacterianos. Posteriormente serealizó el proceso de aislamiento e identificación de género y especie debacteria (Raimundi, 2013; Rivero, 2017).

El proceso de identificaciónde las bacterias fitopatógenas consistió en el aislamiento de las bacterias entejido vegetal enfermo; se utilizó la técnica de inducción al crecimientobacteriano. Se realizaron pruebas bioquímicas, para identificación de especiesde bacterias y prueba de reacción de hipersensibilidad en plantas de tabaco (Nicotiana tabacum L.)por ser una especie no huésped de baterías que afectan alcultivo de café, y de esta mamera comprobar la patogenicidad de las bacteriasidentificadas.

La técnica de inducción al crecimiento para el aislamiento debacterias de tejido vegetal enfermo consistió en la realización de cortes de 5 mmde tejido vegetal con síntomas de enfermedad bacteriana y se desinfectó conhipoclorito de sodio al 0.5 % y alcohol histológico al 95 %, posteriormente selavó con agua destilada estéril y se realizó secado en superficie de papelfiltro estéril, se sembró en cinco platos por muestra y cinco cortes por platoen medio agar nutritivo (AN). Finalmente, los platos se sellaron con Parafilm yrotulados con la debida información (Gutiérrez, 2012).

La identificación de géneros de bacterias fitopatógenas se realizó a partircultivos puros de colonias bacterianas, con crecimiento de 24 horas; estaconsistió, en observar las características morfológicas de crecimiento decolonias bacterianas que incluyen forma, color, aspecto y presencia depigmentos fluorescentes en medio agar Pseudomonas (King B). Serealizaron las pruebas de hidróxido de potasio al 3 % (KOH al 3 %), oxidasa yTinción Gram. Para identificación deespecies se realizaron las pruebas de producción de ácidos a partir desorbitol, celobiosa, trehalosa, sacarosa (Schaad, 2001).

Para las pruebas de hipersensibilidad, se estableció un vivero de plántulas de tabaco. Las plántulas fueron inoculadas cuando alcanzaron un crecimiento entre 20 cm y 25 cm de altura. Por cada plántula se inoculó las bacterias previamente identificadas, un control positivo que consistió en la inoculación de Ralstoniasolanacearum obtenido del laboratorio de microbiología de la Universidad Nacional Agraria (UNA) y un control negativo que consistió en la infiltración agua destilada estéril.

Se preparó una suspensión bacteriana de 1 x10-8 a partir de cultivos puros con 48 horas de incubación. La inoculación se realizó en hojas totalmente expandidas, utilizando una jeringa hipodérmica, para infiltrar la suspensión bacteriana en los espacios intervenales. Las plántulas fueron irrigadas con agua destilada estéril y cubiertas con bolsas plásticas para crear condiciones de humedad. Se evaluó la reacción de hipersensibilidad positiva, mediante la observación de lesiones necróticas localizadas o la presencia de halos cloróticos amarillos a las 48 horas y 72 horas después de la inoculación (Raimundi, 2013).

Las bacterias que resultaron patogénicas fueron seleccionadas de acuerdo con la intensidad de la reacción de hipersensibilidad. Se utilizaron cuatro bactericidas de uso agrícola, estreptomicina más oxitetraciclina 16.5 WP, clorhidrato de oxitetraciclina 5 WP y ácido oxolínico 20 WP y sulfato de cobre 24 SC a diferentes dosis (Cuadro 1). Se utilizaron cuatro dosis por cada producto (dosis mínima de referencia, mínima recomendada, media y máxima recomendada en la etiqueta) con cinco repeticiones por dosis.

La dosis mínima de referencia es menor que la dosis mínima recomendada en la etiqueta del producto y se usó para conocer si las bacterias eran sensibles a esta dosis y de esta manera poder recomendarla para su utilización (Cuadro 1). Para la prueba de sensibilidad a antibióticos, se utilizó el método de Bauer et al, (1966). Este método consistió en preparar una suspensión bacteriana de turbidez 0.5 escala Mackfarland. Con un aplicador de madera punta de algodón humedecido con la suspensión bacteriana se inoculó el medio nutritivo (AN). Posterior a la inoculación se colocaron cuatro discos impregnados con los bactericidas a diferentes dosis y un disco impregnado con agua destilada estéril como testigo negativo.

Se realizó evaluación cualitativa de la sensibilidad a bactericidas en un periodo 24 horas. Consistió en la medición en milímetro del área o halo de inhibición de crecimiento bacteriano, causada por la dosis de bactericida como lo indica el Centro Nacional de Diagnóstico y Referencia (CNDR, 2004). Se consideran sensibles los aislados que no crecieron alrededor del disco impregnado con el bactericida produciendo halos de inhibición mayores de 14 mm, y resistentes los aislados bacterianos que presentaron crecimiento bacteriano alrededor del disco impregnados con el bactericida, mostrando halos de inhibición menores de 14 mm [Clinical and Laboratory Standards Intitute (CLSI, 2016)].

La información obtenida fue analizada de manera descriptiva. Los datos desensibilidad a bactericidas fueron organizados en una base de datos en MicrosoftExcel, luego fueron analizados con el programa estadístico InfoStat, en dondese realizó un análisis de varianza (ANDEVA) y separación de medias con laprueba de Tukey (α= 0.05).

El área de las fincas donde se colectaron las muestras es mayor a 60ha de café. El nivel tecnológico en relación con el uso de insumos es alto, ensistema de producción agroforestales. Lafertilización está basada en análisis químico de suelo, manejo integrado deplagas, así como la aplicación de buenas prácticas agrícolas . La temperatura promedio en las fincas es de 25 ºC y la altitud promedio de 1 068 msnm. Generalmente estasfincas tienen establecido variedades de café Parainema,Marsellesa, Caturra, Pacamara y Catuaí. Las variedadesestablecidas en las fincas son adecuadas para las condiciones agroclimáticas.

Los síntomas en hojas causados porPseudomonas, se observaron cómomanchas de coloración pardo-oscura, de forma irregular y rodeada por haloacuoso amarillo y traslucido, frecuentemente asociadas con manchas necróticascausadas por el complejo de hongos; Cercospora coffeicola (Berk & Cooke), Hemileia vastatrix (Berkeley & Broome) y Mycena citricolor (Berkeley & Curtis). En algunas muestras los síntomas seobservaron manchas necróticas extendidas a lo largo de las nervaduras de lashojas (Figura 1). En bandolas seobservaron manchas necróticas de forma irregular; generalmente las manchas seobservaron en los entrenudos de las bandolas. En los brotes florales lossíntomas fueron manchas pequeñas de coloración pardo-oscura, de forma y tamañoirregular (Figura 2).

Rivero (2013) relaciona el daño de P. syringae con manchas foliares necróticas irregulares, de coloración marrón, rodeadas por un halo amarillento que pueden coalescer, formando grandes áreas necrosadas; reporta que los síntomas ocasionados por las diferentes especies de Pseudomonas a nivel de campo no mostraron diferenciación entre ellos, lo que dificulta su caracterización a nivel de especie.

Según Raimundi (2013), Rivero (2017), las diferentes especies bacterianas patógenas del café producen síntomas similares, razón por la cual la identificación de P. cichorii y P. syringae debe realizarse mediante pruebas bioquímicas y moleculares.

Las bacterias identificadas en las diferentes variedades de café mediante pruebas bioquímicas fueron Pseudomonas cichorii, Pseudomonas syringae y Pseudomonas corrugata. Estas mostraron reacciones positivas a la reacción con KOH 3 % y morfología de bacilos Gram negativos al observarlos al microscopio óptico con tinción Gram. La especie P. cichorii predominó en los crecimientos bacterianos, mientras que las especies P. syringae, se identificó en todas las variedades. La especie de P. corrugata, se identificó en las variedades Pacamara y Caturra (Cuadro 2). Las especies de P. syringae y P. cichorii produjeron pigmentación en el medio nutritivo y King B, la prueba de oxidasa fue positiva para las especies P. cichorii y P. corrugata, mientras que para P. syringae fue negativa. En el caso de las pruebas de carbohidratos P. syringae fue la que mostró capacidad de fermentar la Sacarosa y Trehalosa (Cuadro 3).

Estudio realizadopor Raimundi (2013) en relación con el diagnóstico deenfermedades bacterianas en el cultivo de café identificó mediante técnicasconvencionales a las especies de P. syringae yP. cichorii en las variedades Catuaí y Mundo Nuevo.Otras investigaciones hacen referencia a la identificación de la especie P. syringae mediante morfología y crecimiento en medioscultivos selectivos, a partir de hojas de café (Rivero,2017; Zoccoli et al., 2011).

Los aislados bacterianosidentificados como de P. syringae, P. cichorii y P. corrugata, mostraron resultados positivos a la pruebade hipersensibilidad en tabaco, indicando patogenicidad para el cultivo de café(Figura 3). Estos resultados fueron similares a los obtenidos por Raimundi (2013), Belan et al. (2016), Rivero (2017), que determinaron la patogenicidad de las especies de Pseudomonas cichorii y syringaeaisladas de tejido de café e inoculadas en hojas de plantas de tabaco. Laespecie P. corrugatano ha sido reportada afectando el cultivo de café, sin embargo, se ha registradosu patogenicidad en algunas solanáceas como tomate, tabaco, pimiento y berenjena(Silverio y López, 1994).

Se seleccionaron nueve aislados bacterianos tomando como criterio de selección la intensidad de la reacción en la prueba de hipersensibilidad en tabaco. Los aislados seleccionados fueron cuatro de P. cichorii, tres de P. syringae y dos de P. corrugata. Los antibióticos estreptomicina + oxitetraciclina 16.5 WP inhibió el crecimiento de los aislados bacterianos Pseudomonas cichorii (67F), Pseudomonas corrugata (PBP), Pseudomonas syringae (PAF). Sin embargo, no inhibió el crecimiento en los asilados bacterianos Pseudomonas cichorii (4A, 29B). El ácido oxolínico 20WP inhibió el crecimiento de los aislados bacterianos Pseudomonas cichorii (4A), Pseudomonas corrugata (PBP); sin embargo, no inhibió el crecimiento en los asilados bacterianos Pseudomonas cichorii (67F, 71C).

Clorhidrato de oxitetraciclina 5 WP inhibió el crecimiento de los aislados bacterianos Pseudomonas cichorii (67F), Pseudomonas syringae (PAF), sin embargo, no inhibió el crecimiento en los asilados bacterianos Pseudomonas cichorii (29B), Pseudomonas corrugata (PBP2). Sulfato de Cobre 24 SC no inhibió el crecimiento bacteriano del género Pseudomonas, indicando que las bacterias son resistentes al producto (Cuadro 4, Figura 4).

Schauffler y Di Piero (2017) determinaron que la dosis de 10 mg ml-1 de estreptomicina + oxitetraciclinausado como testigo en Pseudomonas syringae aislada de tomate, presentó halos deinhibición de 16.2 mm, resultando sensible a dicho producto. Scheck y Pscheidt (1998) estudió cepas de P.syringae, pv. Syringaeaisladas de plantas ornamentales y registró resistencia a estreptomicina ysulfato de cobre (CuSO4) en ensayos in vitro. Zoccoli et al. (2011) indicaque la posibilidad de que ocurran interacciones adversas entremetales como el cobre y el medio de cultivo son muy alta, existe la posibilidadde que en el medio de cultivo el cobre no esté disponible, lo que puede llevar a resultados inconclusos.

Las dosis de 240 g200 L-1, 260g 200 L-1 y280 g 200 L-1superaron la dosis de referencia de 100 g 200 L-1 para el caso de estreptomicina másoxitetraciclina (Figura5); mientras que en el ácido oxolínico las dosis de 500 g 200 L-1, 750 g 200 L-1 y 1 000 g 200 L-1 superan a ladosis de referencia de 100 g200 L-1 que produjo menores halos de inhibición (Figura 6). Los mejores resultados, para el casode clorhidrato de oxitetraciclina seobservaron en las dosis de 350 g 200 L-1 y 500 g/200 L-1 (Figura 7). En este estudio los datos de sensibilidad para sulfatode cobre no se ajustaron al modelo estadístico por no mostrar halos deinhibición,además se demuestra que las dosis mínimas para los productos estreptomicina másoxitetraciclina, ácido oxolínico y clorhidrato de oxitetraciclina producen losmismos efectos inhibitorios que las dosis máximas recomendadas para cadaproducto. El bactericidacon ingrediente activo ácido oxolínico mostró mayor efecto de inhibición en elcrecimiento bacteriano.

McManus y Jones (1994) afirman que la oxitetraciclinatiene un efecto bacteriostático y es menos efectiva que la estreptomicina, quetiene efecto bactericida, pero esta es más efectiva cuando se aplica para elmanejo de cepas bacterianas que son resistentes a la estreptomicina.

El género Pseudomonas spp fue el causante de enfermedades bacterianas en el cultivo de café, afectando principalmente hojas, bandolas y flores. Los síntomas se caracterizan por ser manchas de coloración pardo-oscura, de forma y tamaño irregular, rodeada, generalmente por halos acuosos y traslucidos.

Se identificaron especies de bacterias del género Pseudomonas, tales como Pseudomonas cichorii, Pseudomonas. syringae y Pseudomonas corrugata, determinando que son patógenas para el cultivo de café.

Las dosis mínimas para los productos estreptomicina más oxitetraciclina, ácido oxolínico y clorhidrato de oxitetraciclina producen los mismos efectos inhibitorios que las dosis máximas recomendadas para cada producto. El efecto inhibitorio fue visible sobre el crecimiento bacteriano de los aislados Pseudomonas syringae y Pseudomonas corrugata, sin embargo, no inhibieron el crecimiento bacteriano de los aislados Pseudomonas cichorii y el bactericida que mostró mayor efecto de inhibición en el crecimiento bacteriano fue el ácido oxolínico 20 WP.