Identificación molecular y distribución geográfica de siete especies del género Charidotella (Coleoptera: Chrysomelidae) en Panamá

RESUMEN

El género Charidotella (Weise‎, 1896) (Chrysomelidae, Cassidinae), incluye algo más de 100 especies distribuidas desde Canadá hasta el Sur de Argentina. Algunas especies son consideradas plagas agrícolas. Muchas de ellas son sumamente difíciles de distinguir usando caracteres morfológicos. Se evaluó el fragmento correspondiente al código de barras del ADN, del gen citocromo c oxidasa I (COI) en siete especies de Charidotella colectadas en cinco sitios de muestreo de Panamá. Las secuencias se analizaron mediante Neighbor Joining, que produce árboles filogenéticos basados en distancias genéticas. Las especies estudiadas fueron C. ventricosa, C. zona, C. sexpunctata, C. annexa, C. sinuata, C. ambita, C. tumida. La especie más frecuente en los puntos de colecta fue Charidotella sexpunctata y la más cercana a ella según el estudio molecular es C. sinuata. Las especies que se encuentra mayormente distribuida en Panamá es Charidotella sexpunctata.

Palabras clave: Neotrópico; ADN código de barras; Citocromo oxidasa 1; identificación de especies.

ABSTRACT

The genus Charidotella (Weise, 1896) (Chrysomelidae, Cassidinae), includes just over 100 species distributed from Canada to southern Argentina. Some species are considered agricultural pests. Many of them are extremely difficult to distinguish using morphological characters. The DNA barcode fragment, cytochrome c oxidase I (IIC) gene, was evaluated in seven Charidotella species collected at five sampling sites in Panama. The sequences were analyzed using Neighbor Joining, which produces phylogenetic trees based on genetic distances. The species studied were C. ventricosa, C. zona, C. sexpunctata, C. annexa, C. sinuata, C. ambita, C. tumida. The most common species at collection points was Charidotella sexpunctata and the closest to it according to the molecular study is C. sinuata. The species that are mostly distributed in Panama is Charidotella sexpunctata.

Keywords: Neotropics; DNA barcode; Cytochrome oxidase 1; species identification.

INTRODUCCIÓN

Cassidinae es una subfamilia de Chrysomelidae que se encuentra ampliamente distribuida desde Canadá hasta Argentina (Borowiec, 2002). Presenta 6, 319 especies agrupadas en 341 géneros y 36 tribus (Borowiec & Świętojańska, 2014; Chaboo, 2007). Es un grupo muy diverso, principalmente en la región Neotropical. La tribu con mayor número de especies a nivel mundial es Casidini (Lopez-Perez & Zaragoza-Caballero, 2018).

El género Charidotella se caracteriza por el cuerpo pequeño, ovalado, dorso convexo, liso, brillante, los élitros son ligeramente más anchos que el pronoto y los ángulos humerales redondeados o agudos.  Incluye unas 100 especies agrupadas en 5 subgéneros (Borowiec, 1989; Borowiec & Świętojańska, 2002; Buzzi & Andrade, 2005; Borowiec & Świętojańska, 2015), que se distinguen básicamente por caracteres morfológicos en las uñas tarsales (Boriwiec, 1989).

Muchas especies de Cassidini atacan plantas de las familias Convolvulaceae y Asteraceae, como el camote o patata dulce Ipomoea batatas (Convolvulaceae). (Borowiec, 1999; Sultan et al., 2008). Las especies de Charidotella, consideradasplagas del camote son C. sexpunctata, C. flaviae y C. rubicunda (Monte, 1932; Maia & Buzzi, 2005). Charidotella flaviae y C. rubicunda son plagas de Ipomoea carica e Ipomoea batatas y pueden ocasionar la muerte de las plantas al comienzo del desarrollo del cultivo.

La correcta identificación de una especie plaga es fundamental para establecer estrategias de manejo y control de la misma.  Son poco los estudios que se han realizado del género Charidotella y están concentrados en su mayoría en la identificación de nuevas especies y de su comportamiento.

El estudio de la distribución de una especie es una herramienta que aporta información como las preferencias climáticas y ecológicas de la misma. Esta información contribuye también como una herramienta para el establecimiento de planes de control, dentro de un manejo integrado de plagas. Asimismo, es información que puede a aportar a futuros estudios en cuanto a la ecología y distribución del genero Charidotella.

Uno de los géneros más próximo a Charidotella es posiblemente Deloyala (Chevrolat, 1836). Algunas de las especies de Charidotella se separan por diferencias morfológicas sutiles (Borowiec, 2007), razón por la cual los análisis de ADN podrían contribuir a su identificación. 

En este estudio, se evaluó el fragmento correspondiente a los códigos de barras del ADN, del gen mitocondrial citocromo c oxidasa I (COI) en siete especies de Charidotella colectados en cinco sitios de Panamá, para evaluar su utilidad en la correcta identificación taxonómica. La identificación de especies por medio del gen mitocondrial citocromo c oxidasa I, permite la identificación de especies en corto tiempo, constituyéndose una valiosa herramienta de identificación. También se estudió la distribución geográfica de las especies de Charidotella colectadas en Panamá.

MATERIALES Y MÉTODOS

Colecta de las especies

Se seleccionaron cinco puntos de muestreo en Panamá, tomando en cuenta su ubicación geográfica, los cuales fueron debidamente georreferenciados (Tabla 1) donde se colectaron especímenes en forma manual y utilizando una red entomológica.  Los especímenes hallados en cada sitio fueron identificados por morfología mediante claves dicotómicas (Tabla 2) y se preservaron en etanol al 95 a -10 ºC, hasta la realización de los análisis de ADN. Se secuenciaron además especímenes de Deloyala sp., que sirvieron para enraizar el árbol.

Tabla 1. Sitios de colecta establecidos en la presente investigación para los géneros Charidotella y Deloyala en Panamá.

Extracción de ADN y Reacción en cadena de la polimerasa

Se utilizaron 2 individuos por sitio de colecta de las especies pertenecientes a los géneros Charidotella y Deloyala, que fue empleado para enraizar el árbol.  Se trituró el tórax de cada espécimen en 500 µl de una solución buffer CTAB y se agregó 5 µl de 20 µg/µl de proteinasa K.   Se incubó a 65 ºC por 1.5 horas, invirtiendo la muestra a intervalos de 20 minutos.  Seguidamente, las muestras se dejaron enfriar a temperatura ambiente y se les adicionó 15 µl de 50 µg/µl Rnase A, se colocaron en una incubadora a 37 ºC por 2 horas, invirtiéndolas a intervalos de 20 minutos. 

El homogenizado se centrifugó a 14,000 rpm por 5 minutos a temperatura del laboratorio. El sobrenadante se extrajo de cada muestra, con un volumen uniforme de cloroformo: alcohol isoamilico (24:1) por centrifugación a 14,000 rpm por 20 min para la separación de fases.  La fase acuosa fue transferida a un tubo limpio y el paso del cloroformo alcohol isoamilico dos veces.  Se adicionó en la fase acuosa isopropanol frío y se incubó a 4 ºC por 2 horas. 

El precipitado fue colectado por centrifugación a 14,000 rpm a 4 ºC por 30 min, se enjuagó con etanol al 100% y al 70% (-20ºC), respectivamente.  Posteriormente, el precipitado se lavó y se removió el etanol, el concentrado (pellet) que se formó del DNA fue secado al aire, se dejó reposar durante toda la noche en 50 µl de solución buffer 1X TE (10mM Tris-HCl pH 8.0; 0.1 mM EDTA).    

Para la amplificación de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), se siguió a metodología propuesta por Hebert et al., (2003) (DNA barcoding), usando los cebadores LCO1490 (59-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-39) y HCO2198 (59-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-39), para el fragmento de 658 pb, correspondiente al código de barras del gen COI. Las reacciones de PCR fueron conducidas en una mezcla de 20 µl conteniendo 1 µg de DNA extraído previamente, 2 µl   de la solución buffer II 10X PCR; 0.2µl de AmpliTaq;1dNTP´s de 8mm; 1 µl de cada cebador; 2 µl MgCl2 0.8 µl de DMSO y agua doblemente destilada.  El perfil de temperatura fue: 94ºC por 1 min, cinco ciclos de 1 min a 94ºC, 1.5 min a 45ºC y 1.5 min a 72ºC, 35 ciclos de 1 min a 94ºC, 1.5 min a 50ºC y finalmente un ciclo de 5 min a 72ºC.

El producto de la PCR se colocó en un gel de “Low Melting temperature agarose” a una concentración de 1.2% identificar las bandas, se llevó a una temperatura a 70ºC por 5 min, luego se colocó a 45ºC, por 15 min, se le agregó a cada tubo 1.2 µl de gelasa, y se dejaron a una temperatura de 45ºC.

Secuenciación en ciclo

La secuenciación en ciclo se realizó tomando como base los protocolos de Lessios et al., (1996):
2µl de agua doble destilada, 3µl de buffer BD 5X, 1µl del primer “F”/”R”, 1 µl de big dye y 3µl de la banda cortada y tratada con gelasa. Luego se centrifugó por 30 segundos.  Después se llevó al termociclador PTC-200 utilizando el siguiente programa: temperatura inicial de 96 ºC por un min, luego una temperatura de 96 ºC   por 10 segundos, seguido de una temperatura de 50 ºC por 5 segundos, luego a 60 ºC por 4 min, y finalmente 24 ciclos desde el segundo paso.  Al terminar este proceso se le agregó a cada uno, 10 µl de agua doblemente destilada.

Se prepararon las columnas con Sephadex G-50. A los tubos secos se les agregó 10 µl de diformamida y se corrieron las secuencias en una secuenciadora, con una lectura del fragmento del 98.5% de exactitud.

Procesamiento y análisis de los datos

El árbol de Neighbor Joining (NJ) empleado para el análisis molecular, se realizó mediante PAUP*4.0b 10 y fue enraizado mediante Deloyala sp. por ser el género más próximo a Charidotella. El soporte de las ramas se evaluó mediante bootstrap.

RESULTADOS Y DISCUSION

El análisis molecular incluye siete especies del género Charidotella, colectadas en cinco sitios distintos en Panamá (Tabla 1) formando el árbol de NJ obtenido se muestra en la figura 1.

Se obtuvo el dendrograma (Figura 1) de las secuencias  de cada muestra procesada, donde demuestra que la especie C. ventricosa es la más cercana a la base. Dentro del grupo de especímenes de C. ventricosa se encuentra C. tumida, lo cual hace pensar o que ese espécimen fue mal identificado y que pertenece a C. ventricosa, o que estas especies no se diferencia en base a COI. Le siguen en secuencia evolutiva las especies C. zona, C. ambita, C. annexa, C. sinuata y C. sexpunctata. La única relación interespecífica bien soportada (82% bootstrap) es la que agrupa las últimas tres especies. Los dos individuos de cada especie estudiada son idénticos (100% boottrap) al igual que el grupo que incluye a C. ventricosa y C. tumida.

En las especies representadas en más de un sitio (C. ventricosa, C sinuata y C. sexpunctata) no se observa mayor variabilidad genética entre sitios. 

Los análisis realizados demuestran la formación de 6 grupos, el primero evidencia que las especies C. tumida, procedente de Changuinola y C. ventricosa, procedentes de Chiriquí y Valle Rico, presentan una cercana relación genética. Los siguientes cuatro grupos están formados por una sola especie cada uno, los cuales son: el primero por C. zona, procedente de Valle Rico, el segundo por C. ambita, procedente de Changuinola, el tercero por C. annexa, procedente de Las Tablas y el cuarto por C. sinuata, procedentes de Chiriquí y Changuinola.

El último grupo del árbol filogenético está formado por la especie C. sexpunctata, las cuales son procedentes de 3 sitios distintos en Panamá: Gamboa, Valle Rico y Las Tablas. Todos los grupos del dendrograma presentaron un soporte Bayesiano de 100 (Fig. 1). Las especies que genéticamente están más cercanas a C. sexpunctata son C. sinuata, seguida de C. annexa.

En cuanto a la distribución de las especies en Panamá (Tabla 2), la especie que obtuvo mayor número de colectas fue C. sexpunctata, la cual también evidenció mayor desplazamiento en el territorio panameño, según los puntos de colecta (Gamboa, Chiriquí y Valle Rico). Esta especie también ha sido reportada como una de las especies del género Charidotella que está más ampliamente distribuida en el continente americano (Tabla 3).

Las especies C. sinuata fueron colectadas en dos puntos distintos, Chiriquí y Changuinola, los cuales están separados geográficamente por la cordillera Central, los especímenes de estas especies no presentaron diferencias moleculares entre ellas.

La especie que se encontró en un solo sitio de colecta fue C. annexa, en Las Tablas, provincia de Los Santos, a pesar que este sitio es el más cercano a Valle Rico, también provincia de Los Santos, donde se encontraron las especies C. ventricosa, C. zona y C. sexpunctata.

C. ventricosa, también fue localizada en Gamboa, provincia de Panamá y C. tumida, fue encontrada únicamente en Changuinola, provincia de Bocas del Toro, esta provincia colinda con Costa Rica.

Fig. 1. Dendrograma (Neighbor Joining) de siete especies de Charidotella de Panamá, basado en el fragmento de código de barras del ADN de COI. Los valores de bootstrap están indicados debajo de las ramas.

© 2020 Revista Científica de FAREM-Estelí.
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